α-인자 유도 반응의 유도를 밤새 성장한 세포에서 선택 배지에서 로그 상으로 기록하고, 4 × 10 6 세포 / ml로 희석 한 후, 지시 된 농도의 α- 인자와 2 시간 동안 배양 하였다. β - 갈 락토시다 제 분석을 사용하여 이중으로 수행 하였다 비색 기질 이전에 각각의 분석에 대해 2 회 이상의 독립적 인 실험의 평균값이보고되었고, 표준 편차는 항상 10 % 미만이었다. 이어서, 지시 된 시간 간격으로 샘플을 회수하고 포름 알데히드로 고정시키고, 새싹이있는 세포의 백분율을 결정하기 위해 200 개 이상의 세포를 현미경으로 검사 하였다.또한, 세포 분열 정지에 대한 스팟 분석 및 할로 분석 모두에서 유사한 결과가 항상 관찰되었다. α- 인자에 대한 내성 이 염색체 돌연변이가 아닌 플라스미드상의 STE2 유전자 의 돌연변이에 의한 것임을 입증하기 위해 돌연변이 체 세포로부터 플라스미드를 회수하고 신선한 효모 배양 물로 재 전환시켰다 . 약 20,000 개 콜로니의 스크린으로부터 5 개의 플라스미드를 분리 하였다. DNA 서열 분석은 이들이 4 개의 상이한 돌연변이를 나타냄을 보여 주었다; Thr 274 내지 Ala, Tyr 266 내지 돌연변이 수용체의 후속 분석은 α 인자 - 유도 세포 분열 정지를. 이 세트로부터, Y266C 및 N132Y 돌연변이 체는 가장 강한 DN 효과를 가졌고, S207F 및 가장 약한 DN 돌연변이 체 T274A가 뒤 따랐다. α 인자 - 유도 세포 분열 정지 내성을 분석하기 위해, 세포를 10으로 조정 하였다 6 / ㎖, 10 배 희석액을 제조하고, 각 희석 한 후 5 μL 분취 량 α-의 표시된 농도를 함유하는 페트리 접시에 넣고 인자. 세포의 성장은 30 ℃에서 배양 된 균주에 대해 2일 후, 23℃에서 배양 된 세포에 대해 4 일 후에 기록되었다. α- 인자-유도 세포 분열 정지에 대한 헤일로 분석은 대략 3×10 를 퍼짐으로써 수행되었다. 하룻밤 배양에서 적절한 고체 배지로의 세포. α-Factor를 멸균 필터 디스크에 첨가하고 2 일 동안 30 ℃에서 배양 하였다. 적어도 2 개의 독립적 인 분석에서 유사한 결과가 관찰되었다.
DN 돌연변이 체의 유전자 용량 관계. DN 돌연변이 유전자를 확인하기위한 유전자 스크린은 수용체 단백질의 약 10 배 과잉 생산을 초래하는 다중 복사 YEp 플라스미드 벡터를 사용 하였다.
돌연변이 수용체의 과잉 생산이 신호 전달에 대한 그들의 부정적인 영향을 관찰하기 위해 필요한지 여부를 결정하기 위해, DN 수용체 유전자를 일반적으로 세포 당 단일 카피에 존재하는 YCp 플라스미드 벡터에 서브 클로닝 하였다. 도 1 쇼와 네 YCP 벡터에 실시 DN 돌연변이 대립 유전자의 여덟의 효과의 비교. 흥미롭게도, 낮은 카피 수 벡터상에서 돌연변이 유전자를 보유하는 세포가 또한 α- 인자에 내성이기 때문에 돌연변이 수용체의 과잉 생산이 요구되지 않았다. 그러나, 과잉 생산은 돌연변이 수용체의 DN 효과를 향상시켰다.
WT와 DN 수용 체 유전자 간의 유전자 복용량 관계를보다 면밀히 조사하기 위해 WT 수용 체 유전자의 1, 2, 3 또는 4 카피를 운반하는 일련의 사배체 효모 균주에서 4 개의 대표 돌연변이의 효과를 분석했다 ) 게놈에서. 표 2에 나타낸 바와 같이 , STE2의 하나의 게놈 카피를 갖는 세포 는 저 복사 수 플라스미드 상에 돌연변이 유전자를 보유한 경우 α- 인자에 대해 더욱 내성이 있었다. 그러나, YCp 플라스미드 상에 운반 된 DN 돌연변이 체의 간섭 효과 는 게놈에 다수의 STE2 카피를 함유하는 세포에서 덜 두드러지고 , 그들의 효과는 4 개의 게놈 카피 STE2를 갖는 세포에서는 검출되지 않았다. 유사하게, 다중 돌연변이 플라스미드 벡터를 사용하여 WT 수용체를 과잉 생산함으로써 반수체 세포에서 돌연변이 체의 효과를 역전시킬 수도있다. 한편, 멀티 카피 YEp 플라스미드에서 DN 돌연변이 유전자를 운반하는 사배체 세포는 플라스미드 버전을 운반하는 세포보다 α- 인자에 대해 더 큰 저항성을 나타냈다. 또한, 멀티 카피 플라스미드에서 운반 된 DN 돌연변이 유전자는 STE2의 다중 게놈 카피를 갖는 세포에서 α- 인자에 대한 내성을 부여 하였다. 이러한 유형의 유전자 용량 관계는 DN과 WT 수용체의 활성 사이에 화학량 론적 관계가 있음을 나타낸다.
DN 돌연변이 부위. 지배적 인 돌연변이의 예가 거의 없기 때문에, DN 돌연변이에 의해 야기 된 구조적 변화의 영향을 예측하는 것이 특히 흥미로웠다. 돌연변이의 위치가 수용체 단백질의 선형 서열에서 클러스터링되지 않은 것으로 보이기 때문에, 변경된 잔기의 부위를 수용체의 막 토폴로지에 대해 조사 하였다. Ste2p의 막 횡단 토폴로지 모델이 개발되었으며, 여기서 7 개의 TMD 세그먼트는 수로 분석에 의해 예측되고 21 개의 잔류 물 길이가되었다. 연구에서 방향족 아미노산 측쇄가 지질 헤드 그룹으로 분할되고 종종 다른 막 단백질에서이 위치에서 발견되는 것으로 나타났기 때문에 방향족 계면에서 방향족 잔기가 정렬되었다. 수용체 토폴로지에 대한이 모델은 일반적으로 프로그램에 의해 개발 된 것과 같은 다른 모델과 일치 합니다. 이 모델에 맵핑 될 때, DN 돌연변이는 모두 TMD의 세포 외 말단 근처에 위치 하였다. N132Y, S
DN 돌연변이 체의 분리, α-인자 수용체 유전자 우리는 α-요인 페로몬이 발생한다는 사실을 이용했다 MAT에게 S.의 cerevisiae의의 세포 분열을 체포 세포를. 페로몬 신호 전달을 방해하는 수용체 돌연변이 체는 따라서 α- 인자-유도 된 세포 분열 정지에 대한 내성을 증진시키는 능력에 기초하여 단리 될 수있다. 실제로, STE2 유전자를 운반하는 플라스미드를 히드 록실 아민으로 돌연변이시키고 WT STE2를 운반하는 세포에 도입 하였다염색체의 유전자를 확인한 다음 α- 인자를 함유 한 페트리 플레이트에서 성장할 수있는 세포를 확인했습니다. 돌연변이는 각각 TMD3, -5, -6 및 -7의 말단에서 발견되었다.
이전 돌연변이 유발 연구에서 표적화되지 않은 영역 인 TMD의 세포 외 말단에서 DN 돌연변이의 클러스터링을 고려할 때, 그들의 독특한 토폴로지 위치의 중요성을 조사하는 것이 흥미로웠다. 또한, STE2에 돌연변이를 도입하기 위해 PCR을 사용하여 수행 된 별도의 스크린 은 또한 막 횡단 세그먼트의 말단에 맵핑 된 8 개 이상의 돌연변이를 확인 하였다. 모든 수용체 돌연변이가 지배적이지 않다는 것을 입증하기 위해, 본 발명자들은 모두 α- 인자 결합 및 신호 전달에 결함이있는 5 개의 링커 삽입 돌연변이 체 세트를 시험 하였다. 흥미롭게 링커 삽입 돌연변이의 두에 매핑하는 것이 열성 있던 세 링커 돌연변이 반면 세포 것으로 예상 사이트 또는 유사하게 Ste2p의 제 3 세포 내 루프 내의 기능 상실 돌연변이는 특성을 갖지 않았다.
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