유전자 균주의 생장 단점

지난시간에 유전자의 발현에 대해서 공부했습니다. 이번시간에는 좀 더 깊이 공부해보도록 하겠습니다. 일 배체 부족 유전자는 증가 된 카피 수에 민감하다. 복용량 균형 가설은 HI 유전자가 미묘하게 과발현 될 때 독성이 있음을 예측합니다. 즉, 사본 수 증가에도 민감해야합니다. 신진 효모 인 사카로 마이 세스 세 레비 지애는 과발현되거나 과발현 될 때 독성이있는 포괄적 인 용량-변경된 유전자 라이브러리를 생성하기위한 여러 도구가 존재하기 때문에 이러한 예측을 탐색하기위한 이상적인 시스템이다. 이형 접합 결실 수집 각 ∼6000 개의 효모 유전자의 한 카피가 2배체 균주에서 체계적으로 결실 된 곳에서, 게놈 전체 해상도를 연구 할 수있었습니다. 증가 된 카피 수에 대한 민감성을 연구하기 위해, 본 발명자들은 그들의 내인성 프로모터로부터 거의 모든 효모 유전자 를 발현하는 중심 플라스미드로 구성된, 이전에 구축 된 플라스미드 라이브러리를 이용 하였다 . 이 연구의 목적을 위해 우리는“단일 추가 복사”에 존재하는 벡터를 통해 도입 된 유전자를 고려하지만 물론 벡터의 복사 수는 배수성 및 선택 유형에 따라 다를 수 있습니다. 우리는 효모에서 높은 신뢰도 데이터 세트를 생성했다. 이형 접합 결실 수집을 사용하여 30°C에서 2 % 포도당을 함유하는 YEP 배지에서 최대 성장 조건 하에서 충분한 184 개의 유전자를 확인했다. 이들 중에서, 우리는 다음과 같은 기준에 따라 추가로 100 개 고도 유전자를 선택했다. 리보솜 서브 유닛의 결실을 갖는 소수의 균주를 제외하고, 게놈 변형을 유발하는 것으로 알려져있다. 심각한 일 배수 충증을 나타내는 유전자의 대부분은 리보솜 단백질, 전사 및 번역뿐만 아니라 단백질 분해에 필요한 단백질을 암호화한다 고 신뢰성 유전자 세트를 생성 한 후, 본 발명자들은 유전자에 대한 균주 이형 접합체의 성장률을 top_HI 유전자의 여분의 사본을 보유하는 균주의 성장률과 비교 하였다. 놀랍게도, 대부분의 top_HI 유전자는 CEN 플라스미드에서 발현 될 때 증식을 방해했으며, 85/100 균주는 최대 성장 조건에서 통계적으로 유의 한 성장 결함을 나타냈다. 통계적 유의성을 충족시키지 못한 15 개의 균주 중 9 개의 균주는 매우 가변적 인 배가 시간을 나타 냈습니다. 여섯 개 균주는 자신의 코딩 시퀀스는 어떤 돌연변이를 숨겨 없다. 우리는이 6 개 균주에 과잉으로 존재하는 유전자가 효모 세포가 자연 수명주기의 일부로 겪는 최대 성장 이외의 상황에서 독성을 유발할 것을 제안합니다. 카피 수의 변화로 인한 표현형에 대해 증가 된 배수성 버퍼 동일한 유전자의 여분의 사본을 보유하는 균주의 성장 결함과 함께 일 배체 부족 유전자에 대해 이형 적으로 결실 된 균주의 성장 결함의 비교는 성장 결함의 크기가 비례한다는 것을 보여 주었다. 2N-1 균주의 표현형은 일반적으로 심한되 이것은 이전의 연구와 일치하며 ~ 100 개의 유전자 중에서 분석 된 결과, 과발현과 과발현 둘 다에 의해 영향을받는 유전자의 대부분이 발현 증가보다 발현 감소에 더 심각한 결과를 초래한다는 사실을 발견했습니다. 우리는 여러 가지 참고 유전자 이것은 이러한 1N + 1 균주에 대한 배가 시간 측정의 상당한 변동성 때문일 가능성이 높습니다. 우리의 데이터는 또한이 변동성이 상이한 균주 분리 물 사이의 카피 수 변이의 결과이며, 증가 된 카피 수에 가장 민감한 유전자를 함유하는 균주의 배가 시간에 불균형 적으로 영향을 미쳤다 복용량 증가에 유독 한 이유는 무엇입니까? 우리의 결과는 최대 성장 조건 하에서, 단일 카피로 결실 될 때 이배체에서 유의 한 생장 결함을 부여하는 대부분의 유전자가 또한 여분 카피시 생장 단점을 야기한다는 결론을 도출한다. 

과잉 생산시 독성이있는 이유는 무엇입니까? 증가 된 수준의 유전자가 특정 세포 기능을 방해 할 수 있거나 과잉 유전자 생성물의 생성 및 잠재적 후속 분해가 비용이 많이들 수있다. 신진 효모에서 유전자 특이 적 독성에 대한 잘 알려진 예는 β- 튜 불린 인코딩 유전자 TUB2 이다. 유전자의 단일 여분의 카피의 발현은 이배체에서 2 개의 α- 튜 불린 인코딩 유전자 살펴보면, 100 개의 가장 유전자에서 생산 된 RNA와 단백질의 수집은 나머지 게놈에 비해 11 배 더 풍부합니다. top_HI 유전자 중 높은 유전자 발현이 우세는 리보솜 단백질을 암호화하는 유전자. 대량의 과량의 단백질을 생산하는 것이 세포의 전사 및 번역기구에 부담을주는 것으로 알려져 있지만,보다 최근의 연구에 따르면 고도로 발현 된 유전자의 추가 사본이 도입 될 때 세포 성장에 가장 큰 영향을 미치는 단백질 분해에 대한 요구 세포로. 우리는 HI 유전자의 ~65 %가 발견되지 않은 유전자 HI 26 %와 비교하여 하나의 복사본을 초과 부호화시 프로 테아 좀에 의해 분해되는 것으로 알려진 단백질의 생산 도. 프로 테아 좀 표적에 대한 농축은 리보솜 단백질에 의해 다시 구동된다. 이러한 관찰은 과량의 HI 단백질의 분해가 세포에 비용이 많이들 수있는 가능성을 높인다. 이러한 개념에 부합 우리 top_HI 유전자의 여분의 복사본을 보유 98/100 반수체 균주 백 개 균주는의 억제제 라디. 우리 리보솜 단백질을 제외하면 균주의 대부분은 여전히 이러한유도제. 이러한 관찰은 HI 유전자 과다 발현의 독성이 과량의 단백질이 세포의 단백질 항상성기구에 부담을주는 것에 기인한다는 것을 나타낸다. 대부분의 선량 감수성 유전자는 일 배체 충분하지 않다. 미묘하게 유전자 독성 관찰 복용량 균형 가설을 지원합니다. 이 이론에 대한 추가적인 예측은, 적어도 단백질 복합체의 구성원들에있어서, 증가 된 카피 수에 대한 반 수증 충충 증 및 민감성이 상호 정의된다는 것이다. 이 예측을 테스트하기 위해, 우리는 단일 여분의 사본에 존재할 때 체력 단점을 부여하는 유전자를 정의하는 게놈 전체의 데이터 세트를 만들어야했습니다. 이전의 연구는 높은 수준의 과발현에 대한 유전자의 민감성을 특성화 했거나, 그들의 카피 수 한계를 시험 했지만, 최대 성장 조건 하에서 단일 추가 카피로 발현 될 때 체력 결함을 부여하는 유전자를 정의한 사람은 없었다. 효모 플라스미드의 수집을 다시 이용하여, 우리는 각각의 균주가 게놈의 모든 유전자에 대한 유전자의 단일 여분의 카피를 포함하는 반수체 균주의 2 개의 독립적 인 형질 전환 체 풀을 생성 하였다. 우리는 액체 배양 풀을 경쟁하고 48시간 동안 8시간마다 플라스미드 특정 태그를 시퀀싱하여 플라스미드 표현을 모니터링했습니다. 시간이 지남에 따라 각 태그의 풍부함을 따라, 우리는 2646 종 4981 플라스미드에서)에 대한 선형 기울기를 추출 할 수 있었고, 그 중 1588은 재현성 기준을 통과했으며 적합성 점수가 지정되었습니다 각 기울기를 상대적인 피트니스 값으로 변환했습니다. 여기서 1은 중립 피트니스가있는 0의 기울기를 나타내고 <1 또는> 1의 값은 각각 음 또는 양의 기울기를 갖습니다. 체력 값의 분포가 증가하는 인구. 두 형질 풀 검출 유전자가 상대 운동 값 사이의 상관 관계를 보여 주었다. 피어슨 상관 P <0.0001). 유전자는 상대적인 체력이 <1 및 1 SD 미만일 때 체력에 부정적인 영향을 미치는 것으로 간주되었고, SIC로 정의되었다. 이 기준을 사용하여 251 개의 유전자를 SIC로 정의했습니다. 반대로, 평균보다 1 SD가 떨어지고 상대적 적합성이 1보다 큰 247 개의 유전자가있었습니다. 우리는 인구가 풍부하게 증가하는 균주는 알려진 기준점과 비교하여 성장 이점이 없을 가능성이 높다는 것을 주목한다. 오히려, 이들 균주는 배양에서 다른 균주의 상대적 감소로 인해 풍부하게 증가한다.