PCR 증폭에서 리가아제 연결효소

PCR 증폭에서 리가아제 연결효소

리가아제 연쇄 반응 리가 제 연쇄 반응은 공유 상동 타겟 DNA에 대한 결합은 다음 선택된 두 프로브 3 '및 5'바로 두 프로브의 결찰은 2 차 공유 결찰에 대한 새로운 표적을 생성하여, 관심 표적의 기하학적 증폭을 초래한다. 현재, 리가 아제 연쇄 반응에 중심을 둔 상업적 시스템은 없다. 미국 일리노이는이 기술을 활용 한 임상 진단 분석을 중단했습니다. 이 기술은 식품 병원체의 검출을 위해 입증되었습니다 . 리가 제 연쇄 반응 에 리가 아제 연쇄 반응, 서열 두 올리고 뉴클레오티드가 표적 단일 가닥 DNA에 인접한 영역을 보완하는 합성된다. CR 및 LCR은 시험 관내 DNA 증폭 방법이다. 이러한 연쇄 반응에 사용되는 DNA 중합 효소에는 두 가지 유형이 있습니다. 열 안정성 폴리머 라제는 증폭 된 DNA에 가끔 돌연변이를 도입하는 것으로 알려져 있으며; 또한 추가 A를 앰플 리콘의 3'- 말단으로 옮긴다. 열 안정성 교정 용 폴리머 라제는 3'-5 '엑소 뉴클레오타이드 활성을 교정하므로 훨씬 더 낮은 빈도로 돌연변이를 도입하고; 이들 폴리머 라제는 무딘 DNA 말단을 갖는 앰플 리콘을 생성한다. 열 안정성 DNA 폴리머 라제 및 열 안정성 DNA 리가 제를 모두 사용한다. PCR은 시험 관내 DNA 증폭을 위한 표준 선택 방법 인 반면, LCR은 매우 높은 주형 선택성이 필요할 때만 사용되는 특수한 방법입니다. PCR에 대한 반응 조건은 종종 특정 앰플 리콘 및 특정 세트의 프라이머에 대한 최적화를 요구한다. 중요한 매개 변수에는 Mg 2+가 포함됩니다농도 및 사이클링 시간 및 온도 연대. PCR 어닐링 온도의 선택은 특히 필수적입니다. 두 PCR 프라이머 모두에 대한 근접 용융 온도가 일반적으로 바람직하다. 폴리머 라제는 일반적으로 72 ° C에서 반응을 촉매하는데 사용되는 반면, 열 안정성 교정 용 폴리머 라제는 최적 온도가 낮으며 일반적으로 68°C에서 반응을 촉매하는데 사용됩니다. PCR의 성공은 프라이머의 농도와 특정 열 안정성 폴리머 라제의 선택에 달려 있습니다. 열 감수성 폴리머 라제-항체 복합체를 사용하여 핫 스타트 PCR을 시작하면 특이성을 높일 수 있습니다. 이 시나리오에서, 중합 효소는 변성 온도 에서만 활성화되고 초기 저온 오감 이벤트는 최소화됩니다. 이들이 표적과 혼성화 될 때, 열 안정성 리가아제가 이들을 결합시키고, 이들 새로 결찰 된 올리고 뉴클레오티드는 후속 사이클에서 주형으로서 사용된다. 증폭 된 생성물을 검출하기 위해 2개의 상업용 시스템이 이용 가능하다. 증폭 후, LCR 생성물을 스트렙 타비 딘으로 코팅 된 마이크로 타이 터 플레이트에 놓고 비 오티 닐화 된 생성물을 스트렙 타비 딘에 결합시킨다. 세척 후, 검출 올리고 뉴클레오티드가 첨가되고 결합 된 생성물과 혼성화된다. 혼성화는 검출 프로브에 접합 된 효소에 대한 기질의 첨가 후 비색 변화에 의해 검출된다. 앰플 리콘 클로닝의 특정 특징 PCR 앰플 리콘의 클로닝의 특정 특징 P 때때로,PCR 특이성 및 앰플 리콘 수율은 베타 인, DMSO, 디티 오 트레 톨, β- 머 캅토 에탄올, 포름 아미드 및 이들의 칵테일과 같은 PCR 인핸서 물질로 극적으로 개선 될 수있다. 더 긴 PCR 앰플 리콘은 합성하는 데 더 많은 시간이 필요하고 더 엄격한 최적화가 필요합니다. 상이한 교정 용 폴리머 라제의 칵테일은 특히 긴 주형의 증폭을 허용하는 것으로 알려져있다. 추가의 내부 프라이머가 반응에 첨가되어 반응 특이성 및 도달 가능한 앰플 리콘 크기가 증가하고; 이 버전의 PCR을 '조립 PCR'이라고합니다.상이한 교정 용 폴리머 라제의 칵테일은 특히 긴 주형의 증폭을 허용하는 것으로 알려져있다. 추가의 내부 프라이머가 반응에 첨가되어 반응 특이성 및 도달 가능한 앰플 리콘 크기가 증가하고; 이 버전의 PCR을 '조립 PCR'이라고합니다.상이한 교정 용 폴리머 라제의 칵테일은 특히 긴 주형의 증폭을 허용하는 것으로 알려져있다. 추가의 내부 프라이머가 반응에 첨가되어 반응 특이성 및 도달 가능한 앰플 리콘 크기가 증가하고 이 버전의 PCR을 '조립 PCR'이라고합니다. NAAT 검사는 현재 직장, 인두 및 결막에 사용하기 위해 미국 식품의 약국의 승인을받지 않았습니다. 그러나 일부 공립 및 사립 실험실에서는 직장 및 인두 면봉 표본을 사용하여 성능 사양을 설정하여 결과를 환자 관리에 사용할 수 있습니다. 비 생식기 표본에 사용하기위한 성능 사양을 설정하는 실험실은 비고 식 구균 교차 반응으로 특이성이 손상되지 않도록해야합니다 . 생식기 및 비 생식기 해부학 적 부위에서 N. 임질 을 검출하기위한 민감성은 배양보다 우수하지만 유형에 따라 다양하다. 높은 감도는 특이성이 100 %가 아니라는 점에서 상충 관계에 있습니다. 유병률이 낮은 집단에서 스크리닝을 수행하면 위양성 결과가 나타날 수 있습니다. 126 무증상 개체군을 선별 할 때 NAAT를 사용할 때는주의를 기울여야합니다. 보고 된 높은 특이성에도 불구하고 질 면봉으로 불량한 양성 예측 값이 PCR에서 발생할 수 있다는 우려가 있습니다. 저항성 모니터링의 일환으로이 기술을 광범위하게 사용하기 전에 임상 적 분리주에 대한 내성 유전자 마커의 상관 관계가 여전히 필요하다. PCR 프라이머는 벡터 서열과 일치하는 긴 단일 가닥 오버행이있는 PCR 산물을 공급하도록 설계 될 수 있습니다. 이 방법에서, 하나의 우라실 뉴클레오티드가 정방향 및 역방향 PCR 프라이머 모두에 포함되므로, 우라실 DNA 글리코 실라 제 및 엔도 뉴 클레아 제 VIII의 혼합물로 우라실 잔기를 제거함으로써 PCR 단일체에 긴 단일 가닥 오버행이 생성 될 수있다. 벡터 DNA의 상보적인 긴 단일 가닥 오버행은 제한 효소 소화 및 부위 특이 적 닉킹을 통해 얻어진다. 삽입물과 벡터 DNA를 어닐링 한 후에 는 시험관 내에서 연결이 필요 하지 않으며 어닐링 혼합물을 사용하여 박테리아를 변형시킵니다. 표적 증폭 방법 PCR 외에도 핵산을 증폭시키는 다른 많은 기술이 있습니다. 예를 들어, 결찰 기반 증폭 또는 리가 제 연쇄 반응 은 서열-지정 올리고 뉴클레오티드 프라이머 및 열 안정성 DNA 리가 제를 사용하여 DNA에서의 점 돌연변이, 결실 또는 삽입을 분석한다. 가닥-변위 증폭은 일정한 온도에서 DNA 증폭을 수행하기 위해 DNA 폴리머 라제의 고유 한 가닥-변위 활성을 사용한다. 핵산 서열 기반 증폭과 같은 전사 기반 방법 은 시험관 내에서 관여한다RNA 전사. 전사-기반 방법은 PCR에 비해 3가지 주요 이점을 갖습니다. 열 안정성 교정 용 폴리머 라제는 최적의 온도가 낮으며 일반적으로 68°C 에서 반응을 촉진하는 데 사용됩니다. 

PCR의 성공은 프라이머의 농도와 특정 열 안정성 폴리머 라제의 선택에 달려 있습니다. 열 감수성 폴리머 라제-항체 복합체를 사용하여 핫 스타트 PCR을 시작하면 PCR의 특이성을 높일 수 있습니다. 이 시나리오에서, 중합 효소는 변성 온도에서만 활성화됩니다. 초기 저온 잘못 프라이밍 이벤트가 최소화됩니다. 때때로, PCR 특이성 및 앰플 리콘 수율은 베타 인, 디티 오 트레 톨, β- 머 캅토 에탄올, 포름 아미드 및 이들의 칵테일과 같은 PCR 증강제 물질로 극적으로 개선 될 수있다. 더 긴 PCR 앰플 리콘은 합성하는 데 더 많은 시간이 필요하고 더 엄격한 최적화가 필요합니다. 상이한 교정 용 폴리머 라제의 칵테일은 특히 긴 주형의 증폭을 허용하는 것으로 알려져있다. 추가의 내부 프라이머가 반응에 첨가되어 반응 특이성 및 도달 가능한 앰플 리콘 크기가 증가하고; 이 버전의 PCR을 '조립 PCR'이라고합니다. PCR 앰플 리콘이 생성되면 벡터 DNA와의 결찰 전에 정제해야합니다. 오염물은 마이크로 컬럼에서 정제하여 제거 할 수 있습니다. 이 단계는 일반적으로 허용 할 수없는 DNA 희석을 초래하므로, PCR 앰플 리콘은 예를 들어 에탄올-암모늄 아세테이트 침전을 통해 농축되어야합니다. 아세테이트는 에탄올-물 혼합물에 잘 녹고 DNA에 침전되지 않기 때문에 아세테이트 염은 높은 염분 조건을 만드는 데 사용됩니다. 폴리머 라제에 의해 생성 된 단일 뉴클레오티드 오버행은 추가의 A를 그의 PCR 생성물의 3 '말단 각각으로 전달하며, 벡터 DNA에 대한 간단한 연결을 위해 이용 될 수있다. 생성물의 클로닝에 대한 다른 접근법은 클로닝 벡터의 블런트 말단 사이의 후속 라이 게이션으로 생성물을 무딘 것으로 마무리하는 것이며, 아마도 섹션 1.06.10에 기술 된 바와 같이 라이 게이션 혼합물의 제한 소화와 결합된다.. 교정 용 DNA 폴리머 라 제로 생성 된 PCR 산물에 대해서도 유사한 접근법을 사용할 수 있습니다. 이 경우 DNA 조각 끝은 이미 무딘 상태입니다. DNA 단편 결합을 위해 백시 니아 바이러스 DNA- 토포 이소 머라 제에 의존하는 TOPO 클로닝 시스템은 PCR 산물의 TA 클로닝 및 블런트 엔드 클로닝 모두에 적용될 수있다. 추가 클로닝 전략은 플 랭킹 제한 효소 부위를 PCR 생성물로 조작하기 위해 PCR 프라이머에 적합한 인식 서열을 포함시키는 것이다. 이 전략을 따르는 경우, 제한 엔도 뉴 클레아 제에 의한 측면 제한 부위의 효율적인 소화를 보장하기 위해 5'말단에서 프라이머 서열에 일부 뉴클레오티드를 추가하는 것이 중요하다. 문화에 비해이 테스트의 장점은 결과에 비해 신속하고 문화에 비해 높은 감도입니다. 후자는 검사 가 소변 검체, 요도, 질, 직장 및 인두 면봉에 적용되도록 허용했다. 소변 기반 검사 또는 여성의 경우자가 채취 질 면봉을 사용하면 전통적인 클리닉 환경 외부의 인구를 선별하고 임질의 무증상 운반체를 식별 할 수 있습니다. RNA 주형은 증폭 전에 cDNA로 전환 될 필요가 없다. RNA 전사는 등온이므로 PCR과 마찬가지로 열 사이클링 계측이 필요하지 않습니다. 그리고 RNA 산물은 PCR의 DNA 산물보다 덜 안정적이며, 이전에 증폭 된 산물로 시약이 오염 될 가능성이 적습니다. 핵산 증폭 테스트 방법론은 중합 효소 연쇄 반응, 가닥 치환 분석 또는 전사 매개 분석에 의한 특이 적 N. 임질과 DNA 또는 RNA 서열의 증폭을 포함한다 . 리가 제 연쇄 반응 은 더 이상 상업적으로 이용 가능하지 않다. 문화와 비교할 수있는 요도 및 자궁 내막 표본의 감수성과 특이성을보고했습니다.