지배적 음성 돌연변이 체 시험 관내 및 생체 내 단백질 기능 연구를위한 도구
신규 cDNA의 동정 및 서열 분석을위한 강력한 새로운 접근법은 기능을 찾는 단백질의 백 로그를 생성 하였다. 단백질 기능을 규명하기위한 전통적인 접근법은 특히 생체 내에서 특정 단백질의 역할을 확인하는데있어서 상당한 한계를 갖는다. 매우 대안적인 접근법은 그의 기능을 폐지하고 동시에 발현 된 야생형 단백질의 기능을 억제하는 관심있는 단백질의 돌연변이를 조작하는 것이다. 하지만 이러한 접근법은 다수의 상이한 종류의 단백질의 연구에 광범위하게 적용되지만 기능적으로 기능하기 위해 다량 체로 조립해야하는 단백질에 대해 가장 효과적인 경향이있다.지배적 음성 돌연변이 체는 이미 호르몬 수용체, 발암 유전자 및 성장 인자 수용체를 비롯한 다수의 단백질 패밀리의 작용 기전의 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공했으며, 적어도 몇 가지 상 염색체 우성 질환의 원인으로 확인되었다.
막 횡단 세그먼트의G 단백질 연결 α 팩터 수용 체지도
G-단백질-커플 링 수용체는 이종삼 량체 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질을 활성화시킴으로써 광범위한 호르몬 및 감각 자극에 대한 신호를 변환시킨다. 기능 상실 및 구성 적으로 활성 인 수용체 돌연변이 체의 분석은 GPCR의 기능적 특성 및 인간 질병에서의 그들의 역할을 밝히는 데 도움이되었다. 우리는 효모 G- 단백질 결합 α- 인자 수용체에 대 한 새로운 클래스의 돌연변이, 지배적 인 부정적인 돌연변이의 식별 설명. 야생형 수용체를 발현하는 세포에서 짝짓기 페로몬에 대한 반응을 억제하는 능력에 기초하여 16개의 지배적 음성 수용체 돌연변이 체를 단리 하였다. 가장 강한 돌연변이 체 수용체 중 두 가지에 대한 자세한 분석은 다른 GPCR 간섭 돌연변이 체와 달리이들은 원형질막에 적절하게 위치되어 야생형 수용체의 안정성 또는 위치를 변경하지 않았다. 또한, 그들의 지배적 음성 효과는 야생형 수용체의 상대적 양에 반비례하였고 G- 단백질 서브 유닛을 과발현함으로써 역전되어, 이들 돌연변이 체가 G단백질에 대한 야생형 수용체와 경쟁 함을 시사한다. 흥미롭게, 지배적 음성 돌연변이는 막 횡단 세그먼트의 세포 외 말단에 모두 위치하여 수용체 신호 전달에 중요한 수용체의 신규 영역을 정의한다. 전부,우리의 결과 리간드 바인딩 및 수용 체 활성화에 특별히 관련 된 α-인자 수용 체의 잔류 물을 식별 하 고 GPCRs 비활성화 할 수있는 새로운 메커니즘 다른 G 단백질 연결 수용 체에서 수용 체 돌연변이 평가에 대 한 중요 한 의미를 정의합니다.DN 돌연변이 체에서의 억제 표현형은 단백질의 모든 기능이 아닌 일부의 손실을 의미하기 때문에, 이들 돌연변이 체는 다른 수용체 시스템에서 큰 이점을 위해 사용되어왔다. 예를 들어, 수용체 티로신 키나제의 경우, 돌연변이 체는 특정 기능을 특정 구조적 특징에 할당하거나 수용체 신호 전달의 차단 효과를 연구하기 위해 사용되어왔다. GPCR에 대해보고 된 많은 돌연변이의 관점에서, 지배적 인 GPCR 돌연변이의 예가 거의 없다는 것이 흥미 롭습니다. 또한, 시험 된 경우, GPCR에서의 지배적 인 돌연변이는 주로 WT 수용체의 기능이 아닌 원형질막에 대한 수용체의 표적화에 영향을 미치는 것으로 보인다. 따라서, 본 발명자들은 효모 S의 유전자 접근성을 이용하여 DN 돌연변이 체의 분석이 GPCR에 적용될 수 있는지를 결정하고자 하였다 . 이 보고서에서 우리는 알파 팩터 페로몬 수용 체에서 DN 돌연변이 식별을 설명합니다. 흥미롭게도, 본 발명의 결과는 이들 돌연변이 체가 G단백질에 대해 경쟁함으로써 WT 수용체의 활성을 방해한다는 것을 나타낸다. 또한, 이러한 돌연변이는 수용체 기능에 중요한 TMD의 세포 외 측면에서 새로운 도메인을 확인한다.
G- 단백질-커플 링 수용체는 효모에서 인간까지 광범위한 진핵 생물에서 발견되는 광범위한 수용체 계열을 포함합니다. 이 수용체는 호르몬, 신경 전달 물질 및 기타 화학 메신저를 포함한 다양한 자극에 반응합니다. GPCR은 이종삼 량체 구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질의 α 서브 유닛을 자극하여 GTP에 결합함으로써 그들의 신호를 전달한다 . 이는 βγ 서브 유닛으로부터 α 서브 유닛을 방출 한 다음, α 서브 유닛 또는 βγ 서브 유닛 중 하나가 특정 경로에 따라 신호 전달을 촉진한다.
GPCR은 세포 내 및 세포 외 루프에 의해 연결된 7 개의 막 횡단 도메인을 포함한다는 점에서 구조적으로 유사하다. 수용체 기능을 연구하기 위해 많은 기술이 적용되었지만 GPCR 활성화 메커니즘에 대한 많은 지식은 돌연변이 수용체의 특성에서 비롯됩니다. 기능 상실 및 과민성 돌연변이 체는 리간드 결합, G-단백질 활성화 및 신호의 하향 조절에 필요한 수용체 영역을 확인하는 데 도움이되었다. 또한, 구성 적으로 활성 수용체 돌연변이의 연구는 수용체 활성화에 대한 현재 모델의 개발에 핵심적인 역할을 수행했습니다. 자연 발생 GPCR 돌연변이는 또한 많은 인간 질병에 연루되어 있습니다. 흥미롭게도, 상이한 돌연변이 수용체의 분석은 GPCR이 유사한 기능을 위해 공통 구조 도메인을 이용한다는 것을 나타낸다. 특히, 제 3 세포 내 루프는 광범위한 GPCR에서 G- 단백질 활성화에 필수적인 역할을한다.
효모 사카로 마이 세스 세 레비 지애에서 가능한 유전자 접근법 은 G-단백질 결합 짝짓기 페로몬 수용체의 구조와 기능 사이의 관계를 조사하는 데 사용되었다. α 인자 및 알파-인자 페로몬 매우 포유류 신호 경로 함께 보존 된 G 단백질의 신호 전달 경로 활성화 일곱 TMDS 수용체와 결합함으로써 접합 효모 유도. 구성 돌연변이 및 기능 상실 돌연변이는 G- 단백질 활성화에서 세번째 세포 내 루프를 암시한다. 돌연변이 유발 연구는 또한 세포질 C 말단이 G- 단백질 활성화에 필요하지 않지만 세포 내 이입에 의한 수용체의 하향 조절 및 인산화에 의한 수용체의 탈감작에 관여한다는 것을 나타낸다. 또한, 키메라 수용체에 대한 연구는 α- 인자 결합에 대한 특이성이 막 관통 및 세포 외 영역을 포함하는 α-인자 수용체의 불연속 세그먼트에 의해 결정됨을 시사합니다. α- 인자 수용체의 중요한 도메인 중 일부가 이들 연구에서 확인되었지만, 수용체 신호 전달의 분자 메카니즘은 여전히 결정되어야한다.
지배적 음성 돌연변이 체는 돌연변이 체 수용체가 수용체의 야생형 버전의 기능을 방해하는 중요한 부류의 돌연변이를 나타낸다. 실제로, 일부 인간 GPCR은 페로몬 신호 경로가 효모로 표현 될 때 페로몬 신호 경로를 활성화시킬 수 있습니다. 기능 상실, 과민성 및 구성 적으로 활성 인 α- 인자 수용체 돌연변이 체의 분석은이 수용체의 활성화 및 조절을위한 메커니즘을 밝히기 시작했다. 예를 들어, 구성 적으로 활성 인 돌연변이 체의 분석은 막 횡단 세그먼트에서의 움직임이 α-인자 수용체 활성화에 중요한 역할을한다는 것을 나타낸다.
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